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反相色譜柱的優(yōu)點(diǎn)和影響因素

更新時間:2018-05-02瀏覽:6858次

液相色譜柱通常分為正相柱和反相柱。正相色譜柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相色譜柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。

反相色譜柱的優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定,應(yīng)用廣泛,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動相的PH值小于2時,會導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。

反相色譜柱的影響因素:

(1)柱長
有機(jī)小分子和肽類的分辨率隨柱長的增加而增加.但是柱長增加并不能使蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率顯著增加.它們在較短的柱子上往往也有很好的分離效果。
(2)流動相的流速。
有機(jī)小分子和肽類的分辨率對流動相流速非常敏感。而蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的分辨率則不然。流速越小,柱子越長,色譜峰的寬度就越大,分辨率就越小。制備色譜上樣過程中的流速對動態(tài)吸附容量影響很大。
(3)溫度。
溫度上升,流動相黏度下降,流動速度加快,且流動相與固定相之間的傳質(zhì)速度加快,使分辨率增加。同時,溫度上升,分子熱運(yùn)動增加,疏水性作用減弱。升高溫度要考慮目標(biāo)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
(4)流動相組成。
流動相的極性越大,溶質(zhì)的分配系數(shù)越大,洗脫時間越短。RPC多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法。水是極性zui強(qiáng)的溶劑,在反相色譜中常常和基礎(chǔ)溶劑配合使用,向流動相中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機(jī)溶劑,以得到不同強(qiáng)度的流動相,這些有機(jī)溶劑稱為修飾劑。反相色譜中zui常用的有機(jī)溶劑有甲醇和乙腈。此外,乙醇、四氫呋喃、異丙醇及二氧六環(huán)也常被用作修飾劑。有機(jī)溶劑梯度的大小也會影響分辨率,一般梯度越?。直媛试酱蟆?/p>

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